Cadmium phytotoxicity and trophic transfer to isopods

O cádmio (Cd) é um metal não essencial e é considerado um poluente prioritário pela comunidade europeia. Este metal atinge o ambiente no decurso de várias actividades antropogénicas e tende a concentrar-se nos solos e sedimentos, onde está potencialmente disponível para as plantas, sendo posteriormente transferido através da cadeia trófica. Neste contexto, o principal objectivo da presente dissertação foi o estudo dos efeitos da assimilação e da acumulação de Cd em plantas e as suas consequências para animais consumidores. Numa primeira fase, foram estudados os principais efeitos fisiológicos e genotóxicos do Cd em plantas. As plantas de alface (Lactuca sativa L.) expostas a Cd apresentaram um decréscimo na eficiência fotossintética, aumento de peroxidação lipídica e alterações significativas na actividade de enzimas de stress oxidativo. Estas alterações culminaram num decréscimo do crescimento da parte aérea no final da exposição. As respostas obtidas pelos parâmetros bioquímicos sugerem que estes poderão ser utilizados como eventuais biomarcadores em testes ecotoxicológicos com Cd em abordagens integrantes em conjunto com parâmetros clássicos. Os efeitos mutagénicos de Cd foram avaliados através da determinação da instabilidade de microsatélites (IM). Não foi observada IM, nem nas folhas nem nas raízes de plantas de alface com 5 semanas de idade expostas a 100 μM Cd durante 14 dias, no entanto observou-se IM em raízes de alface exposta a 10 μM Cd durante 28 dias desde a germinação. A idade da planta e a maior acumulação de Cd nas raízes poderão explicar os resultados obtidos. A clastogenicidade de Cd foi analisada em três espécies vegetais com diferentes capacidades de destoxificação e acumulação de metais através de citometria de fluxo. Foram detectadas alterações significativas nos parâmetros analisados em raízes alface, mas não nas espécies Thlaspi caerulescens J & C Presl e Thlaspi arvense L. Estes resultados sugerem que o stress provocado pelo Cd originou clastogenicidade como consequência da perda de porções de cromossomas, uma vez que o conteúdo de ADN nuclear diminuiu. A transferência trófica através da cadeia alimentar permanece muito pouco estudada em termos ecotoxicológicos. A distribuição subcellular de metais num organismo pode ser utilizada para compreender a transferência trófica de um metal na cadeia alimentar. Como tal, numa última parte é estudado de que modo a distribuição subcellular do Cd em plantas com perfis de acumulação de Cd distintos afecta a biodisponibilidade e transferência trófica de Cd para isópodes. A distribuição de Cd entre as 4 fracções subcelulares obtidas através de centrifugação diferencial revelou a existência de diferenças significativas entre as espécies de plantas. Estes resultados em conjunto com a avaliação directa da eficiência de assimilação (EA) de Cd individual de cada uma das quatro fracções subcelulares das plantas em estudo, resultou em informação de grande relevância para a explicação das diferenças observadas na EA de Cd por parte de isópodes alimentados com folhas de diferentes espécies de plantas. Com base nos resultados obtidos, o Cd ligado a proteínas estáveis à temperatura (e.g. metaloteoninas e fitoquelatinas) é o menos biodisponível, sendo assim o que menos contribuiu para a transferência trófica, enquanto que o Cd ligado a proteínas desnaturadas pela temperatura foi a fracção mais disponível para transferência trófica de Cd ao isópode. Estes resultados realçam a relevância ecológica da distribuição subcelular de Cd em plantas que tem influência directa na tranferência trófica deste metal para os consumidores e ainda o facto de que alterações na distribuição subcelular de Cd em plantas devido a diferentes mecanismos de destoxificação poderá ter um impacto directo na transferência trófica de Cd para o animal consumidor.

Aluminium toxicity in wheat and rye

Com o presente trabalho pretendeu-se determinar e compreender melhor quais os alvos do Alumínio (Al) nas plantas, e contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos de tolerância presentes em genótipos com elevado grau de tolerância ao Al. O Al é um dos maiores constituintes do solo e torna-se biodisponível em solos com baixo pH. Nesses casos, a exposição ao Al afecta negativamente o crescimento das plantas conduzindo a uma diminuição da produção. Estes factos são especialmente visíveis nos cereais, sendo a exposição ao Al uma das principais causas das quebras de produção nestas espécies. O Capítulo I consiste numa revisão geral sobre a toxicidade do Al nas plantas, apontando os seus principais alvos. Apresenta também os mecanismos de resistência, que inclui Al-destoxificação externa e interna, em diferentes espécies. O Capítulo II aborda os estudos sobre a exposição de curto prazo ao Al em duas espécies de cereais: Triticum aestivum L. e Secale cereale L., tendo-se sempre utilizado um genótipo Al-tolerante e um Al-sensível para cada espécie. Este capítulo está dividido em três estudos: no Capítulo II.1 realça-se o efeito da exposição a 185 μM de Al no equilíbrio nutricional em trigo. Verificou-se que em ambos os genótipos (sensível e tolerante) o perfil de macro e micro nutrientes se alterou, tendo uma interferência negativa, sobretudo no nível de P, Mg e K. Além disso, registaram-se diferenças na diferenciação da endoderme consoante o grau de tolerância/sensibilidade do genótipo. No Capítulo II.2 apresenta-se uma visão mais abrangente dos efeitos da exposição a 185 μM de Al em trigo, incluindo parâmetros fisiológicos, estruturais, citológicos e genotóxicos. Demonstra-se, pela primeira vez, que a progressão do ciclo celular é diferentemente regulada, dependendo da tolerância/sensibilidade do genótipo e que, mesmo em zonas já diferenciadas da raiz a exposição ao Al leva à deposição de calose. O Capítulo II.3 aborda os efeitos da exposição de 1.1 mM de Al em centeio, numa perspectiva bastante alargada. Apresenta-se o desequilíbrio nutricional, sobretudo no genótipo sensível, assim como a translocação de Al para a parte aérea nesse mesmo genótipo. Analisa-se também o comportamento de ambos os genótipos no que se refere ao ciclo celular, diferenciação da endoderme, crescimento radicular, reservas de hidratos de carbono, entre outros. Os resultados apontam para estratégias bem definidas adoptadas pelo genótipo tolerante de forma a minimizar a acção do Al no sistema radicular. O Capítulo III compreende a exposição longa ao Al. Dois genótipos de centeio com diferentes graus de tolerância ao Al foram expostos a 1.11 mM e 1.85 mM de Al durante 21 dias, tendo sido usados dois pontos de amostragem (15 e 21 dias). Este capítulo está dividido em dois estudos: No Capítulo III. 1 analisamse os mecanismos antioxidantes (folhas e raízes) como resposta à exposição ao Al, dando-se especial atenção ao ciclo do ascorbato-glutationas. A exposição ao Al levou a stress oxidativo e a alterações na actividade de enzimas antioxidantes e no conteúdo de antioxidantes não-enzimáticos. Demonstra-se que os dois órgãos apresentam respostas diferentes à exposição ao Al e que a capacidade de sobreviver em ambientes ricos em Al depende da eficácia da resposta antioxidante. Para além disso, a resposta do ciclo ascorbato-glutationas parece estar dependente do tipo de órgão, grau de tolerância e do tempo de exposição ao Al. No Capítulo III. 2 analisam-se os efeitos da exposição ao Al na fotossíntese. Verificou-se que o Al afecta negativamente a taxa fotossintética em ambos os genótipos, embora as alterações que o Al provoca nas trocas gasosas e no Ciclo de Calvin sejam dependentes do genótipo. Verificou-se também que os danos no genótipo sensível surgem mais cedo do que no genótipo tolerante, mas que ambos apresentam susceptibilidade ao Al após exposição de longo termo. Por fim, no Capítulo IV são apresentadas as conclusões da Tese de Doutoramento.

Mitochondrial dysfunction in fatty acid β-oxidation disorders

Mitochondria are central organelles for cell survival with particular relevance in energy production and signalling, being mitochondrial fatty acid β–oxidation (FAO) one of the metabolic pathways harboured in this organelle. FAO disorders (FAOD) are among the most well studied inborn errors of metabolism, mainly due to their impact in health. Nevertheless, some questions remain unsolved, as their prevalence in certain European regions and how pathophysiological determinants combine towards the phenotype. Analysis of data from newborn screening programs from Portugal and Spain allowed the estimation of the birth prevalence of FAOD revealing that this group of disorders presents in Iberia (and particularly in Portugal) one of the highest European birth prevalence, mainly due to the high birth prevalence of medium chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency. These results highlight the impact of this group of genetic disorders in this European region. The characterization of mitochondrial proteome, from patients fibroblasts with FAOD, namely multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MADD) and long chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (LCHADD), provided a global perspective of the mitochondrial proteome plasticity in these disorders and highlights the main molecular pathways involved in their pathogenesis. Severe MADD forms show an overexpression of chaperones, antioxidant enzymes (MnSOD), and apoptotic proteins. An overexpression of glycolytic enzymes, which reflects cellular adaptation to energy deficiency due to FAO blockage, was also observed. When LCHADD fibroblasts were analysed a metabolic switching to glycolysis was also observed with overexpression of apoptotic proteins and modulation of the antioxidant defence system. Severe LCHADD present increased ROS alongside with up regulation of MnSOD while moderate forms have lower ROS and down-regulation of MnSOD. This probably reflects the role of MnSOD in buffering cellular ROS, maintain them at levels that allow cells to avoid damage and start a cellular response towards survival. When ROS levels are very high cells have to overexpress MnSOD for detoxifying proposes. When severe forms of MADD were compared to moderate forms no major differences were noticed, most probably because ROS levels in moderate MADD are high enough to trigger a response similar to that observed in severe forms. Our data highlights, for the first time, the differences in the modulation of antioxidant defence among FAOD spectrum. Overall, the data reveals the main pathways modulated in FAOD and the importance of ROS levels and antioxidant defence system modulation for disease severity. These results highlight the complex interaction between phenotypic determinants in FAOD that include genetic, epigenetic and environmental factors. The development of future better treatment approaches is dependent on the knowledge on how all these determinants interact towards phenotype.!

Synthesis and biological activities of polyphenolic hybrids - evaluation of anti-cancer, anti-inflammatory and antioxidant activities

Os compostos polifenólicos constituem uma classe de metabolitos secundários de plantas, mas existe também uma enorme quantidade de derivados sintéticos ou semi-sintéticos contendo múltiplas unidades fenólicas. Estes compostos apresentam importantes características biológicas, que dependem das suas estruturas básicas. Certos derivados desta família de compostos, tais como flavonoides, cromonas e cumarinas contribuem para os benefícios da dieta humana, e partilham o núcleo de benzopiran-(2 e 4)-ona ou benzofuran-3-ona. A presente dissertação inclui uma introdução geral e três capítulos que descrevem as novas rotas sintéticas estabelecidas para a preparação de novos híbridos de diversos compostos polifenólicos, assim como a sua elucidação estrutural e termina com a presentação dos resultados da avaliação biológica desses mesmos compostos. No segundo capítulo discute-se a preparação de híbridos de pirimidina- e imidazolidina-polifenóis, especialmente a síntese diastereoseletiva de novos híbridos benzofuran-3-ona-hidantoína e derivados de uracilo. A rota sintética envolve a ação de carbodiimidas sobre os ácidos cromona-(2- e 3)-carboxílicos num só passo ou em dois passos sequenciais, catalisada por uma base orgânica ou inorgânica. O terceiro capítulo descreve reações do tipo adições conjugadas 1,4 - hetero-ciclisações em cascata de compostos 1,3-dicarbonílicos em ácido cromona-3-carboxílico catalisadas por uma base orgânica, que originaram novas cromonas, cromanonas e flavonas polissubstituídas. As bispiranonas [bispiran-2 e 4)-onas] foram elaboradas numa reacção de acoplamento da 4-hidroxicumarina ou da lactona do ácido triacético com o ácido cromona-3-carboxílico ou precursores formil-funcionalizados (ω-formil-2’-hydroxy acetofenonas e cromona-3-carbaldeídos) utilizando organocatálise básica. Finalmente, alargou-se o estudo das adições conjugadas 1,4 para uma variedade de 4-hidroxipiran-2-onas e cetonas α,β-insaturadas para originar novos análogos de warfarina. Obteve-se uma variedade de estruturas complexas por hibridação das unidades de 4-hidroxicumarina ou da lactona do ácido triacético com os novos derivados de cromonas polissubstituídas. Todos as reações foram executadas em condições suaves e ambientalmente favoráveis, utilizando a 4-pirrolidinopiridina como organocatalisador básico. As estruturas dos novos híbridos polifenólicos foram caracterizados por técnicas espectroscópicas de alta resolução, incluindo espectroscopia de ressonância magnética nuclear (1D e 2D) e por difractometria de raios-X, que nos permitiram resolver o complexidade estrutural dos compostos sintetizados. O quarto capítulo apresenta os resultados da avaliação biológica obtidos com os híbridos polifenólicos sintetizados neste trabalho, mostrando a possibilidade de seu envolvimento na terapia do cancro. A maioria dos compostos foram avaliados quanto ao seu efeito sobre a citotoxicidade e proliferação de células leucémicas e ao seu envolvimento na regulação de via pró-inflamatória NF-kB, na qual, os híbridos de biscumarinas exibiram actividades elevadas (IC50 = 6-19 μM para inibição de NF-kB depois de 8 horas de incubação e IC50 = 15-39 μM para efeitos citotóxicos em células cancerosas, após 24 horas de incubação). Uma inibição moderada das enzimas HDAC e Cdc25 foi induzida pelos derivados de benzofuran-3-ona-hidantoína. Catorze dos novos derivados polifenólicos polissubstituídos, tendo como estrutura básica a benzopiran-4-ona, foram avaliados pela sua actividade quimiopreventiva do cancro mediada pela indução de sinalização citoprotectora Nrf2 (fator 2 relacionado com o fator nuclear da proteína E2) e capacidade para inibir a proliferação das células de cancro da mama. Os derivados da classe das cromanonas foram identificados como os indutores mais potentes da actividade Nrf2. As concentrações necessárias para aumentar a actividade de luciferase em 10 vezes (C10) foram de 2,8-21,3 μM. Todos os novos híbridos polifenólicos que apresentam atividade citotóxica e anti-proliferativa não afectam o crescimento de células saudáveis periféricas do sangue (PBMC) (IC50 > 50 μM), indicando a sua seletividade para as células cancerosas e sugerindo que alguns deles são estruturalmente interessantes para posteriores análises. A avaliação da atividade antioxidante utilizando os testes do radical livre DPPH e o poder redutor do ião férrico FRAP foram realizados em algumas estruturas híbridas polifenólicas.

Antioxidant and detoxify genes polymorphisms in colorectal cancer predisposition

Colorectal cancer (CRC) results from histologic and gene alterations can lead to a massive cellular proliferation. Most of the authors assume multifactorial causes to CRC genesis. Low physical activity, a fat diet poor in fibers and smoking habits seems to have an important role in CRC. However, there are also genetic causes associated with CRC risk. It has been described that oxidative stress levels could influence CRC development. Thus, cellular balance reactive species and defense enzymes involved in oxidative stress are crucial to maintain a good tissue function and avoid neoplasic process. Therefore, genome variations on these defense enzymes, such as MNSOD, SOD3, GSTP1, GSTT1 and GSTM1, could be important biomarkers to colorectal adenocarcinomas. We intend to determine frequencies distribution of most common polymorphisms involved on oxidative stress regulation (MNSOD, SOD3, GSTP1, GSTT1 and GSTM1) in patients with sporadic colorectal adenocarcinoma (SCA) and in healthy controls, evaluation their possible correlation with SCA risk. Samples common polymorphisms of antioxidant and detoxify genes (MNSOD T175C, SOD3 R213G, GSTP1 A105G, GSTP1 C114T, GSTT1del and GSTM1del) analysis was done by PCR-SSP techniques. In this study we found a higher prevalence of MNSOD 175CC (55% vs 2%; p<0.0001; OR: 58.5; CI 13.3 to 256.7), SOD3 213GG (31% vs 2%; p<0.0001; OR: 21.89; CI 4.93 to 97.29), GSTP1 105GG (46% vs 12%; p<0.0001; OR: 6.14; CI 2.85 to 13.26), GSTP1 114TT (38% vs 0%; p<0.0001; OR: Infinity) and GSTT1 null (75% vs 28%; p<0.0001; OR: 7.71; CI 3.83 to 15.56) mutated genotypes among SCA patients, while the normal genotypes were associated with SCA absence. Furthermore, we found GSTP1 114TT mutated genotype (52% vs 27%; p=0.003; OR: 2.88; CI: 1.41 to 5.89) and GSTT1 null genotype (87% vs 65%; p=0.003; OR: 3.66; CI 1.51 to 8.84) associated with colon samples. These findings suggest a positive association between most of common polymorphisms involved on oxidative stress regulation and SCA prevalence. Dysregulation of MNSOD, SOD3, GSTP1, GSTT1 and GSTM1 genes could be associated with an increase of ROS in colon and rectum tissue and p53 pathway deregulation, induced by oxidative stress on colonic and rectal cells. The present study also provides preliminary evidence that MNSOD 175C, SOD3 213G, GSTP1 105G, GSTP1 114T and GSTT1 null polymorphisms, may be involved in SCA risk and could be useful to clarify this multifactorial disorder.

Extracção supercrítica de óleo de grainha de uva combinada com pré-tratamentos enzimáticos

Neste trabalho estudou-se a extracção supercrítica do óleo de grainha de uva, usando dióxido de carbono, e combinou-se este processo com um prétratamento enzimático da semente para aumentar o rendimento global da extracção. A qualidade dos extractos obtidos foi avaliada pelo seu conteúdo em triacilglicerídeos, perfil de ácidos gordos e capacidade antioxidante. Realizaram-se também alguns estudos exploratórios sobre a aplicação de um pré-tratamento de alta pressão (HPP) à grainha da uva. Adicionalmente, efectuou-se o estudo da extracção, fraccionamento e caracterização estrutural das procianidinas da grainha da uva, bem como a avaliação da sua capacidade antioxidante. A extracção de procianidinas da grainha da uva foi efectuada sequencialmente com metanol e acetona/água, tendo sido posteriormente fraccionadas por adição sucessiva de misturas metanol/clorofórmio progressivamente mais concentradas em clorofórmio. A caracterização das procianidinas foi feita por HPLC-UV e LC–MS, antes e depois de sujeitar as amostras a uma tiólise, e também por ESI-MS e ESI-MS/MS. Este estudo permitiu reportar, pela primeira vez, a ocorrência de procianidinas do tipo-A galoiladas na grainha da uva. Os resultados de HPLC-UV permitiram determinar o grau médio de polimerização das procianidinas e a sua composição monomérica em (+)- catequina, (-)-epicatequina e (-)-epicatequina-O-galato. Mostrou-se que a (+)- catequina é o flavan-3-ol terminal mais abundante e a (-)-epicatequina predomina largamente como unidade de extensão. No caso de procianidinas do tipo A, a ligação interflavânica C2-C7 encontra-se essencialmente nas unidades terminais. O grau médio de polimerização das diversas fracções varia entre 1.0 e 10.8. A sua capacidade antioxidante, medida pelo método espectrofotométrico de DPPH•, mostrou-se ser equivalente à de uma amostra comercial de (+)-catequina usada como referência. A partir dos graus médios de polimerização experimentais e das análises de FTIR das fracções correspondentes foi possível obter um modelo preditivo O-PLS com apenas uma variável latente. O pré-tratamento enzimático justificou-se pelo conhecimento existente acerca do uso de enzimas específicas que destroem parcialmente as paredes celulares. Atendendo à composição das paredes celulares da grainha da uva preparou-se uma suspensão contendo protease, xilanase, pectinase e celulase. Para determinar as condições experimentais do pré-tratamento que maximizam o rendimento da extracção, estudou-se o efeito do tempo de reacção, temperatura, pH, diâmetro médio das partículas de grainha moída e a concentração das enzimas. Os incrementos do rendimento da extracção de óleo observados atingiram 163.2%. O estudo da extracção supercrítica (SFE) do óleo da grainha de uva tratada e não-tratada permitiu obter as curvas de extracção correspondentes, bem com analisar a influência das condições operatórias sobre o seu andamento. Montou-se uma instalação laboratorial onde se realizaram experiências com dióxido de carbono a 160, 180, 200 e 220 bar e temperaturas de 313.15 e 323.15 K. Os rendimentos obtidos por SFE foram semelhantes aos de Soxhlet com n-hexano. As curvas de extracção medidas compreendem um primeiro período de extracção, onde se remove cerca de 92-97% do óleo disponível, e um segundo período, essencialmente difusional, com pouco impacto no rendimento final. Os vários extractos recolhidos e o óleo global obtido foram caracterizados para avaliar a sua qualidade e relacioná-la com as condições operatórias de SFE. Determinaram-se o conteúdo total em triacilglicerídeos, o seu perfil de ácidos gordos e a capacidade antioxidante (AOC). Os resultados mostraram que a AOC aumenta com a elevação da pressão e, acentuadamente, com o acréscimo da temperatura. Ao longo da curva de extracção, a AOC é mais pronunciada nos extractos iniciais, nomeadamente nos primeiros 30 a 40% da extracção. A modelação efectuada considerou que o óleo extractável se reparte entre células rompidas, predominantes na periferia da semente, e células intactas, mais interiores. Admitiu-se que o transporte de massa ocorre em série, i.e. das células intactas para as rompidas e destas para o solvente; mostrou-se que a dispersão axial era desprezável. Os balanços materiais à fase fluida e aos volumes de células rompidas e intactas, combinados com os fluxos interno, externo e a relação de equilíbrio foram resolvidos numericamente pelo método das linhas combinado com diferenças finitas atrasadas. O modelo reproduziu bem as curvas experimentais e permitiu simular curvas de eluição e os três perfis de concentração no leito.

Toxicity assessment of essential metals in aquatic detritivores

Os contaminantes provenientes quer de fontes naturais quer como consequência da atividade humana, têm contribuído para a degradação dos ecossistemas aquáticos. Entre estes encontram-se os metais que podem, ou não ser essenciais mediante o papel que desempenham no metabolismo dos organismos. O cobre e o zinco são exemplos de metais essenciais, contudo quando atingem concentrações elevadas podem tornar-se tóxicos. Os detritívoros aquáticos desempenham um papel fundamental na decomposição da matéria orgânica, alimentando-se de carcaças e partes de plantas que caem nos cursos de água. Assim, estes organismos permitem que o ciclo dos nutrientes se complete e servem como elo de ligação entre todos os grupos funcionais do ecossistema mantendo o seu equilíbrio estrutural e funcional. Sendo a matéria orgânica a sua principal fonte de energia estão sujeitos à contaminação existente no meio, pelo que é de todo o interesse proceder-se à avaliação dos efeitos da toxicidade de metais nestes organismos. Uma vez que as diferenças comportamentais consequentes desta exposição podem originar variações na densidade e diversidade, o que se refletirá a nível das comunidades, originando alterações na estrutura e funcionamento do ecossistema. Tendo em vista a avaliação dos efeitos da contaminação por metais em detritívoros, o principal objetivo deste trabalho foi comparar a sensibilidade a metais essenciais de dois detritivoros aquáticos, o camarão Atyaephyra desmarestii e o anfípode Echinogammarus meridionalis. Para tal, avaliaram-se os efeitos do cobre e do zinco a diferentes níveis de organização biológica. Primeiro, foram determinadas as preferências alimentares de A. desmarestii e E. meridionalis considerando tanto a área das folhas como a contaminação por metais das folhas. Em seguida, avaliaram-se os efeitos do cobre e do zinco na sobrevivência e inibição alimentar de ambas as espécies. Finalmente, avaliaram-se os efeitos destes mesmos metais a nível bioquímico utilizando uma bateria de biomarcadores que incluiu enzimas de stresse oxidativo, o sistema de defesa antioxidante e as colinesterases. Ambos os organismos não mostraram preferência em relação a folhas de área diferente. A presença de uma maior ou menor concentração de metais essenciais no alimento não teve qualquer influência na sua escolha pelo alimento (contaminado ou não). Os ensaios agudos de cobre e zinco mostraram que o cobre é mais tóxico para ambas as espécies do que o zinco. O camarão demonstrou ser mais sensível ao zinco que o anfípode, tendo este sido mais sensível ao cobre ( CL50 do cobre para A. desmarestii foi de 0,128 mg.l-1 e o de E. meridionalis foi de 0,050 mg.l-1; os valores correspondentes para o zinco foram 7,951 e 11,860 mg.l-1, respectivamente. Em relação aos efeitos subletais, o cobre teve efeitos notórios na taxa de alimentação de E. meridionalis, mas não afectou a de A. desmarestii. No que diz respeito à exposição ao zinco, ambas as espécies parecem apresentar tendência para inibir a alimentação. A caracterização das colinesterases revelou que a principal forma presente em ambas as espécies é a acetilcolinesterase, a qual que não foi afetada pela presença dos metais, no caso do camarão, mas parece ser inibida pelo zinco no caso do anfípode. O cobre inibiu o sistema de defesa enzimático de ambas as espécies, sem sinais de danos lipídicos. Para além disto, inibiu uma das enzimas antioxidantes (GPx) do anfípode. Apesar de não ter ocorrido dano lipídico após exposição ao cobre, observou-se um ligeiro aumento dos níveis das LPO, o que pode ser indicativo de uma potencial existência de dano oxidativo, como resultado da falha do sistema de defesa antioxidante. Por outro lado, o zinco induziu o sistema de defesa em E. meriodionalis prevenindo o dano lipídico. Enquanto em A. desmarestii o sistema enzimático antioxidante não respondeu, tendo ocorrido dano celular oxidativo considerando-se, assim, que o sistema de defesa antioxidante do camarão pode ser comprometido por exposição a metais. Ainda que os danos celulares oxidativos tivessem ocorrido a baixas concentrações de zinco. A exposição a este metal também induziu a actividade da GST de E. meriodionalis. Considerando que a taxa de alimentação foi severamente reduzida no caso deste organismo, o zinco parece ser o metal cuja concentração no ecossistema requer maior atenção. Integrando as respostas dos biomarcadores parece também evidente que A. desmarestii responde de uma maneira geral a maiores concentrações dos dois metais, enquanto a resposta de E. meridionalis ocorre a concentrações inferiores. Pelo que, E. meridionalis parece ser mais sensível ao nível bioquímico. Neste trabalho, os dois detritívoros, com ligeiras diferenças no modo como utilizam a matéria orgânica disponível, apresentam diferenças na sensibilidade aos metais essenciais a vários níveis de organização biológica, sendo o zinco o metal que poderá causar maior preocupação a nível bioquímico, enquanto o cobre parece ser o mais tóxico ao nível do organismo, causando mortalidade a concentrações mais baixas.

Genotoxic risk of herbicides to Anguilla anguilla L.

No contexto dos contaminantes aquáticos, os herbicidas são considerados como um dos grupos mais perigosos. Uma vez aplicados, estes são facilmente transportados para cursos de água, quer devido a uma pulverização pouco cuidada ou devido a fenómenos de escorrência superficial e/ou subterrânea. A presença destes agroquímicos no ambiente tem vindo a ser associada a efeitos nefastos em organismos não-alvo, como é o caso dos peixes. Contudo, existe ainda uma grande lacuna no que diz respeito à informação científica relacionada com o seu impacto genotóxico. Deste modo, a presente tese foi delineada com o intuito de avaliar o risco genotóxico em peixes de duas formulações de herbicidas: o Roundup®, que tem como princípio activo o glifosato, e o Garlon®, que apresenta o triclopir na base da sua constituição, produtos estes largamente utilizados na limpeza de campos agrícolas, assim como em florestas. Foi ainda planeado desenvolver uma base de conhecimento no que diz respeito aos mecanismos de dano do ADN. Como último objectivo, pretendeu-se contribuir para a mitigação dos efeitos dos agroquímicos no biota aquático, nomeadamente em peixes, fornecendo dados científicos no sentido de melhorar as práticas agrícolas e florestais. Este estudo foi realizado adoptando a enguia europeia (Anguilla anguilla L.) como organismo-teste, e submetendo-a a exposições de curta duração (1 e 3 dias) dos produtos comerciais mencionados, em concentrações consideradas ambientalmente realistas. Para a avaliação da genotoxicidade foram aplicadas duas metodologias: o ensaio do cometa e o teste das anomalias nucleares eritrocíticas (ANE). Enquanto o ensaio do cometa detecta quebras na cadeia do ADN, um dano passível de ser reparado, o aparecimento das ANE revela lesões cromossomais, sinalizando um tipo de dano de difícil reparação. O ensaio do cometa foi ainda melhorado com uma nova etapa que incluiu a incubação com enzimas de reparação (FPG e EndoIII), permitindo perceber a ocorrência de dano oxidativo no ADN. No que diz respeito ao Roundup®, o envolvimento do sistema antioxidante como indicador de um estado próoxidante foi também alvo de estudo. Uma vez que as referidas formulações se apresentam sob a forma de misturas, o potencial genotóxico dos seus princípios activos foi também avaliado individualmente. No caso particular do Roundup®, também foram estudados o seu surfactante (amina polietoxilada; POEA) e o principal metabolito ambiental (ácido aminometilfosfórico; AMPA). Os resultados obtidos mostraram a capacidade do Roundup® em induzir tanto dano no ADN (em células de sangue, guelras e fígado) como dano cromossómico (em células de sangue). A investigação sobre o possível envolvimento do stresse oxidativo demonstrou que o tipo de dano no ADN varia com as concentrações testadas e com a duração da exposição. Deste modo, com o aumento do tempo de exposição, os processos relacionados com o envolvimento de espécies reactivas de oxigénio (ERO) ganharam preponderância como mecanismo de dano no ADN, facto que é corroborado pela activação do sistema antioxidante observado nas guelras, assim como pelo aumento dos sítios sensíveis a FPG em hepatócitos. O glifosato e o POEA foram também considerados genotóxicos. O POEA mostrou induzir uma maior extensão de dano no ADN, tanto comparado com o glifosato como com a mistura comercial. Apesar de ambos os componentes contribuirem para a genotoxicidade da formulação, a soma dos seus efeitos individuais nunca foi observada, apontando para um antagonismo entre eles e indicando que o POEA não aumenta o risco associado ao princípio activo. Deste modo, realça-se a necessidade de regulamentar limiares de segurança para todos os componentes da formulação, recomendando, em particular, a revisão da classificação do risco do POEA (actualmente classificado com “inerte”). Uma vez confirmada a capacidade do principal metabolito do glifosato – AMPA – em exercer dano no ADN assim como dano cromossómico, os produtos da degradação ambiental dos princípios activos assumem-se como um problema silencioso, realçando assim a importância de incluir o AMPA na avaliação do risco relacionado com herbicidas com base no glifosato. A formulação Garlon® e o seu princípio activo triclopir mostraram um claro potencial genotóxico. Adicionalmente, o Garlon® mostrou possuir um potencial genotóxico mais elevado do que o seu princípio activo. No entanto, a capacidade de infligir dano oxidativo no ADN não foi demonstrada para nenhum dos agentes. No que concerne à avaliação da progressão do dano após a remoção da fonte de contaminação, nem os peixes expostos a Roundup® nem os expostos a Garlon® conseguiram restaurar completamente a integridade do seu ADN ao fim de 14 dias. No que concerne ao Roundup®, o uso de enzimas de reparação de lesões específicas do ADN associado ao teste do cometa permitiu detectar um aparecimento tardio de dano oxidativo, indicando deste modo um decaimento progressivo da protecção antioxidante e ainda uma incapacidade de reparar este tipo de dano. O período de pós-exposição correspondente ao Garlon® revelou uma tendência de diminuição dos níveis de dano, apesar de nunca se observar uma completa recuperação. Ainda assim, foi evidente uma intervenção eficiente das enzimas de reparação do ADN, mais concretamente as direccionadas às purinas oxidadas. A avaliação das metodologias adoptadas tornou evidente que o procedimento base do ensaio do cometa, que detecta apenas o dano nãoespecífico no ADN, possui algumas limitações quando comparado com a metodologia que incluiu a incubação com as enzimas de reparação, uma vez que a última mostrou reduzir a possibilidade de ocorrência de resultados falsos negativos. Os dois parâmetros adoptados (ensaio do cometa e teste das ANE) demonstraram possuir aptidões complementares, sendo assim recomendado a sua utilização conjunta com vista a efectuar uma avaliação mais adequada do risco genotóxico. Globalmente, os resultados obtidos forneceram indicações de grande utilidade para as entidades reguladoras, contribuindo ainda para a (re)formulação de medidas de conservação do ambiente aquático. Neste sentido, os dados obtidos apontam para a importância da avaliação de risco dos herbicidas incluir testes de genotoxicidade. A magnitude de risco detectada para ambas as formulações adverte para a necessidade de adopção de medidas restritivas em relação à sua aplicação na proximidade de cursos de água. Como medidas mitigadoras de impactos ambientais, aponta-se o desenvolvimento de formulações que incorporem adjuvantes selecionados com base na sua baixa toxicidade.

Natural substances and high pressure processing to preserve sea bass

Esta tese teve como objectivo estudar estratégias de conservação de pescado fresco, recorrendo ao uso de extractos e óleos essenciais de plantas e do processamento por alta pressão (HPP), usando filetes de robalo como um caso de estudo modelo. Relativamente aos extractos e óleos essenciais, avaliaram-se as suas propriedades antibacterianas e antioxidantes. Os extractos aquosos quente de poejo e de orégão e o óleo essencial de cravinho apresentaram a maior actividade antioxidante. Os óleos essenciais foram mais eficientes do que os extractos para inibir o crescimento das estirpes bacterianas testadas, tendo-se observado os menores valores de concentração mínima inibitória nos óleos essenciais de orégão, citronela, alho e orégão Espanhol. De seguida, estudou-se o efeito dos óleos essenciais de orégão Espanhol e de limão na conservação de filetes de robalo fresco tendo em conta critérios microbiológicos, químicos, físicos e sensoriais. A aplicação do óleo essencial de orégão Espanhol aumentou o tempo de vida útil dos filetes sob o ponto de vista bacteriano, mas não em termos sensoriais. A combinação dos óleos essenciais de orégão Espanhol e de limão melhorou o efeito antioxidante e reduziu a intensidade do odor e a sua eficácia em relação às Enterobacteriaceae, comparando com o tratamento com óleo essencial de orégão Espanhol per se. No sentido de reduzir o odor conferido pelos óleos essenciais realizou-se um estudo de conservação para avaliar o efeito de películas com óleos essenciais (citronela, alho e tomilho) em filetes de robalo, recorrendo a uma teste de desafio bacteriano. As películas sem óleos essenciais aumentaram o tempo de vida útil sob o ponto de vista bacteriano, mas este efeito não foi observado com a incorporação dos óleos essenciais nas películas. Em relação ao HPP, testaram-se diversas condições (nível de pressão, tempo de pressurização e taxa de pressurização) e avaliaram-se os efeitos na actividade enzimática, na qualidade global e na conservação de filetes de robalo fresco. Em geral, o aumento do nível de pressão e do tempo de pressurização diminuiu a actividade da fosfatase ácida e das enzimas proteolíticas, a carga bacteriana e a capacidade de retenção de água, enquanto que os filetes ficaram mais brancos. O HPP revelou potencial para o desenvolvimento de novos produtos: mais brancos, não translúcidos, mais firmes e com maior tempo de frescura e estabilidade microbiológica. Em conclusão, os óleos essenciais e o HPP têm potencial para conservar pescado fresco, devido aos seus efeitos na qualidade bacteriana. Ainda assim, mais esforços devem ser feitos no sentido de reduzir a transferência de odor dos óleos essenciais para o pescado e os efeitos do HPP no aspecto do pescado e na oxidação lipídica.